高效液相色譜法測定蜂王漿中羥甲基糠醛含量

本實驗在參考前人研究的基礎上，對提取方法、線性范圍、方法適用性等方面進行研究，結合實際樣品的測定，建立一種穩定、靈敏度高、適應性好的蜂王漿中羥甲基糠醛含量的測定方法。
1 材料與方法
※分析檢測食品科學2008, Vol. 29, No. 03 413
1.1 儀器與試劑
P 6 8 0 高效液相色譜儀 D i n o e x 公司；固相萃小柱ENVI-C18(500mg，6ml)；固相萃取裝置 Supelco 公司；Turbo Vap LV 氮氣吹干儀；離心機 Sigma 公司。羥甲基糠醛標準品(97.0%) Sigma公司；磷酸(優級純) ；甲醇(色譜純) ；乙酸鋅溶液(150g/L)；亞鐵氰化鉀溶液(300g/L)；10% 的甲醇水溶液(10ml 甲醇與90ml水混合)；實驗用水為超純水。
標準溶液的配制：準確稱取標準品，用去離子水
配制成0.5mg/ml 的儲備液。分析前用流動相配制成一系列不同濃度的標準工作溶液。
1.2 樣品處理
稱取5g 試樣，精確到0.001g，置于50ml 容量瓶中，加入30ml 水振蕩溶解。待樣品溶解后，分別加入3ml 乙酸鋅溶液和3 m l 亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白，用水定容至刻度，混勻，靜置1 0 m i n 。將溶液轉移到離心管中，在5 0 0 0 r / m i n 離心1 0 min，取上清液，待凈化。將E N V I - C 1 8 萃取柱固定在萃取裝置上，分別加入5ml 甲醇、10ml 純水活化平衡，保持柱的濕潤。取15ml濾液到固相萃取柱中，上清液以不大于3ml/min 流速通過固相萃取柱，待液體完全流完后，用5 m l 1 0 % 甲醇水溶液清洗固相萃取小柱；真空減壓抽干后，用5 m l 甲
醇洗脫于1 0 m l 刻度試管中。將洗脫液用氮吹儀吹干后，用0.5ml 流動相溶解，樣液經過0.45μm 的濾膜過濾后，上液相色譜儀測定。
1.3 液相色譜條件
色譜柱: Waters Symmetry-C18(4.6mm × 250mm，5μm ，W a t e r s 公司)；流動相：0 . 4 % 磷酸水溶液+ 甲醇(90+10)；流速0.8ml/min；檢測波長285nm；柱溫30℃；進樣量2 0μl。
2 結果與分析
2.1 提取方法的優化
2.1.1 沉淀劑的選擇
常用的沉淀蜂王漿蛋白的試劑有無水乙醇溶液，磷酸溶液，鹽酸溶液，偏磷酸溶液，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液等，經過實驗，這些溶液均能很好的將蜂王漿中的蛋白沉淀。但由于羥甲基糠醛對強酸，熱和氧化劑敏感，當用磷酸、鹽酸、偏磷酸溶液時，羥甲基
糠醛的回收率很低，有可能在提取過程中，發生了分解。8 0 % 的乙醇水溶液對蜂王漿中羥甲基糠醛提取有很高的回收率，但在進一步凈化前，需要用蒸發儀蒸干，而由于乙醇和水的混合液沸點很高，需要長時間的揮發，這不僅延長了測試樣品的時間，而且在揮發的過程中羥甲基糠醛很容易降解，因此本實驗選擇乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑。通過優化實驗確認，乙酸鋅溶液的濃度為150g/L；亞鐵氰化鉀溶液濃度為300g/L，各使用3 m l 就可以有效的將蜂王漿中蛋白沉淀，并獲得很好的提取回收率。
2.1.2 固相萃取小柱的選擇
對比了BAKERBOND SPETM C18(500mg/6ml)；ODS(C18)PHASE(500mg/6ml)；ACCUBOND ODS(C18)(500mg/6ml)；Oasis HLB(500mg/6ml)小柱和ENVI-C18(500mg/6ml)五種反相固相萃取柱對蜂王漿樣品的凈化效果。實驗表明，五種固相萃取柱差異較大，EN V I - C 1 8 小柱的回收率最高(90% 以上)，Oasis HLB 和BAKERBOND SPETM C18的回收率在7 5 %～8 5 %，O D S ( C 1 8) P H A S E 和A C C U B O N DO D S ( C 1 8 )柱的回收率在6 0 %～8 0 %。因此，本方法選擇E N V I - C 1 8 固相萃取柱為凈化柱。
2.2 液相色譜柱的選擇
分別選用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm，5μm)，Diamonsil C18 (4.6mm × 250mm，5μm)，Waters Nova-Pak C18 (3.9mm × 150mm，5μm)，μBondapak C18 (4.0mm× 3 0 0 m m，1 0μm )四種色譜柱對蜂王漿中羥甲基糠醛進行了色譜條件的實驗。實驗發現，這四種色譜柱都可以用于對羥甲基糠醛含量的分析，只有保留時間和靈敏度有所不同，Symmetry C18 柱靈敏度和峰型均很好，所以我們選用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm，5μm)色譜柱進行羥甲基糠醛的測定。標準圖譜與實際樣品分離圖譜
見圖1 。
2.3 線性關系和檢出限
用羥甲基糠醛標準儲備溶液分別配制濃度為0 . 1 0、0.20、1.0、2.0、5.0、20.0mg/L 標準溶液，在選定的色譜條件下進行測定，進樣量2 0μl ，用峰高與標準濃度作圖，線性方程為Y=2.3772X+0.024，線性相關系數R2=0.9993。當檢測0.10mg/L 標準濃度時，所測譜圖的信噪比大于1 0 。根據最終樣液所代表的試樣量、定容體積和進樣量計算，確定本方法檢出限為0 . 2 m g / k g。
2.4 回收率和精密度
在樣品上做0.2、1、5、10mg/kg 四個添加水平的加標回收率實驗，每個濃度重復四次，測定的平均回收率及精密度見表1。在0.2～10mg/kg 添加濃度范圍內，回收率在87.2%～93.1% 之間，相對標準偏差小于3.4%，能夠滿足蜂王漿中羥甲基糠醛含量的常規分析。
2.5 實際樣品的測定
添加濃度 (mg/kg) 0.2 1 5 10
回收率Intra-daya 89.4±3.4 89.2±2.1 92.2±2.3 93.1±1.1
(%, X ± SD) Inter-dayb 87.2±3.1 91.7±3.2 91.2±2.7 92.3±2.5
表 1 蜂王漿中羥甲基糠醛的添加回收率
Table 1 Recoveries of hydroxymethylfurfural in royal jelly
注：Intra-daya 為日內添加回收率，測定4次；Inter-dayb 為日間添加回
收率，測定4 次。
414 2008, Vol. 29, No. 03 食品科學※分析檢測
隨機從市場上購買的蜂王漿樣品1 4 個，采用本實驗建立的高效液相色譜方法對樣品進行分析，實際測定
結果見表2 。
結果表明，大多數樣品中都檢出了羥甲基糠醛，檢出樣品中羥甲基糠醛的含量在0.9～26.4mg/kg 之間。
羥甲基糠醛有可能能成為評價蜂王漿質量和貯存效果的指標之一。
3 結 論
蜂王漿樣品基質復雜，富含蛋白質、脂類等物質。本實驗采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉降蛋白，結合固相萃取方法，有效地降低了基質干擾。方法回收率在87.2%～93.1% 之間，相對標準偏差為0.9%～3.4%，該方法具有方便、準確、靈敏度高、精密度好等優點，是一種測定蜂王漿中羥甲基糠醛的有效方法。